Печать ДНК на лету

Геномный принтер работает почти как струйный, только у него выше точность и больше объем капель. Вместо чернил прибор печатает реагентами, позволяющими создавать олигонуклеотиды — небольшие кусочки ДНК или РНК.

Проект разрабатывают специалисты трех томских университетов (ТУСУРа, Томского государственного университета и Сибирского государственного медицинского университета), Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) и НИЦ Курчатовский институт. Промышленный партнер проекта — АО «НПФ “Микран”», участник проекта «Национальные чемпионы». Он принимает участие в разработке и производстве функциональных узлов и опытного образца.

Производством оборудования для синтеза олигонуклеотидов и массивов олигонуклеотидов для создания генных конструкций в мире занимаются всего несколько компаний. И в другие страны такое оборудование не поставляется. Поэтому создание отечественного геномного принтера обеспечит технологическую независимость для проведения исследований в области генетических технологий. По оценкам разработчиков, спрос на такие устройства на российском рынке будет исчисляться десятками, если не сотнями.

«Сборка протяженных ДНК — это только одна из областей применения. К тому же в сфере ГМО в России действуют законодательные ограничения, поэтому это применение пока имеет только научный интерес, — рассказал “Стимулу” один из авторов разработки, заведующий лабораторией аддитивных технологий и инженерной биологии ТУСУРа Руслан Гадиров. — Но геномный принтер можно использовать и для других задач. Например, сейчас договорились о совместных работах с Институтом онкологии, они разрабатывают панель для NGS-секвенирования известных форм рака, а мы попробуем ее синтезировать. Скорее всего, пока принтер будет наиболее востребован именно для создания библиотек олигонуклеотидов под NGS».

Для масштабных задач

Свою историю этот проект ведет с 2021 года. Тогда ТУСУР победил в конкурсе Минобрнауки и получил на его реализацию 410 млн рублей. Через два года исследователи создали прототип устройства, а в декабре 2024-го успешно синтезировали длинную последовательность нуклеотидов — до 80 оснований.

«Ранее мы синтезировали цепочки длиной до 31 основания. Но мы понимали, что этого недостаточно. Для многих задач необходимы цепочки длиной 60‒80, а иногда и 100‒120 оснований. Поэтому на данном этапе мы поставили перед собой задачу синтезировать цепочки до 80 оснований и увеличить плотность массива», — пояснил Руслан Гадиров.

Длинные цепочки — от 100 до 120 оснований — необходимы, к примеру, для диагностики онкозаболеваний. Кроме того, часто перед молекулярными биологами стоит задача встроить ген в бактерию, чтобы она начала синтезировать нужный белок. Для решения такой задачи нужны двухцепочечные молекулы ДНК длиной в несколько тысяч пар оснований, и собрать их проще из массива длинных цепочек олигонуклеотидов. Это можно делать и с помощью планшетных синтезаторов, но такой синтез будет гораздо дороже и займет много времени.

Ученые постоянно работают над усовершенствованием своего синтезатора. Разработчикам удалось добиться стабильной работы: система может полностью осуществлять синтез в автоматическом режиме. Ведется доработка процесса печати «на лету».

«Сейчас печать осуществляется “от точки к точке”. Печатная головка перемещается в нужную точку, останавливается, выполняется дозирование, после чего головка перемещается в следующую точку. Это достаточно медленная методика раскапывания. Мы работаем над тем, чтобы печатающие головки выполняли дозирование в процессе движения, “на лету”, — рассказывает Руслан Гадиров. — Это сложная задача, поскольку погрешность в координатах дозирования из разных дозаторов на протяжении всего синтеза не должна превышать 10 микрометров (для сравнения: толщина человеческого волоса составляет около 50 микрометров). Однако такой способ дозирования позволит проводить печать на гораздо больших скоростях. Особенно это будет заметно, когда работа будет вестись с большими массивами олигонуклеотидов: удастся заметно сократить время синтеза».

Заведующий лабораторией аддитивных технологий и инженерной биологии ТУСУР Руслан Гадиров

Пресс-служба ТУСУРа

Томский синтезатор

Теперь расскажем, из каких частей состоит и как действует синтезатор, разработанный томскими учеными. Печатающую каретку, на которой располагаются пьезоэлектрические и игольчатые дозаторы, а также обзорная камера, перемещает координатограф. Он обеспечивает повторяемость не хуже 3 мкм. Для этого в принтере по всем трем осям используются системы обратной связи с разрешением 1 мкм.

Игольчатые дозаторы обеспечивают сплошную заливку реагентами всей подложки, а пьезоэлектрические — точное дозирование (капли объемом порядка 400 пиколитров). Именно пьезодозаторами ведется поточечное прецизионное дозирование амидофосфитов и активатора, служащих строительными блоками в цепочках ДНК/РНК.

Немного остановимся на самой подложке. Как рассказывает Руслан Гадиров, в начале проекта было не совсем понятно, с какими подложками лучше работать. «Дело в том, что совместимость со стандартными реагентами, которые применяются на планшетных и колоночных синтезаторах, требует, чтобы подложки имели пористую структуру. Поэтому в итоге мы остановились на анодированном оксиде алюминия — нанопористом материале с канальным расположением пор. Он имеет большую удельную площадь поверхности, его поры — это, по сути, непересекающиеся вертикальные сквозные каналы, которые не дают капле растекаться в плоскости подложки, что позволяет обеспечить высокую плотность синтеза», — пояснил исследователь.

В результате кроме возможности работать со стандартными реагентами разработчики получили преимущество по масштабу синтеза более чем в сто раз по сравнению с гладкими поверхностями (например, предметными стеклами или кремниевыми пластинами). Но для работы с такими подложками пришлось разработать модуль размещения подложек — вакуумный столик, который фиксирует пористую подложку и обеспечивает откачку реагентов сквозь нее на некоторых стадиях синтеза.

Перед использованием подложки проходят определенную химическую модификацию, для того чтобы на поверхности пор появились якорные группы, на которых возможен рост олигонуклеотидов.

«Олигонуклеотидный синтез является твердофазным. Не в том плане, что мы смешиваем твердые реагенты, а в том, что синтез происходит на поверхности твердой фазы. Для того чтобы на поверхности нашей твердой фазы шла реакция, необходимо предварительно создать на ней якорные группы — или, как говорится, выполнить функционализацию поверхности. Якорная группа — это группа, одним концом ковалентно связанная с поверхностью твердой фазы (подложки), через которую будут пришиваться все последующие звенья. Если мы попытаемся выполнить синтез на подложке, на которой нет этих якорных групп (то есть на подложке без функционализации), мы ничего не синтезируем, так как реагенты будут просто смываться с подложки, поскольку им не к чему “якориться”», — поясняет Руслан Гадиров.

Реагенты попадают на подложку, внутри пор происходит химическая реакция, после чего с помощью вакуума они удаляются, а по поверхности пор подложки, где оказывали воздействие эти реагенты, «пришивается» буква.

Но пьезодозатор — достаточно деликатное устройство. Если на его поверхности в процессе испарения растворителя образовался микрокристаллик растворенного вещества, это сильно ухудшает качество дозирования, капли отклоняются, их объем и скорость меняются, появляются сателлиты или вообще дозирование останавливается.

Поэтому перед началом раскапывания выполняется проверка работоспособности пьезодозаторов. Для этого на платформе установлена камера со стробоскопическим подсветом. Стробоскоп позволяет детально определить характеристики капель (объем, скорость и траекторию, наличие сателлитов). Если капли из всех нужных на данном этапе дозаторов удовлетворяют критериям работоспособности, то выполняется печать, если же какой-то из дозаторов начал работать нестабильно — система выполняет процедуру прочистки. Для этого в принтере есть модули промывки и просушки дозаторов, в которых кончик каждого дозатора ополаскивается растворителем и затем избытки жидкости промокаются на специальную салфетку.

«С наполнением принтера разобрались, — продолжает Руслан Гадиров. — Но рядом с ним еще есть стойка управления. Помимо различной электроники и пневматики в ней располагается шприцевая станция, включающая до 16 отдельных шприцевых модулей, при помощи которых реагенты из емкостей по трубкам поступают в пьезоэлектрические и игольчатые дозаторы. Шприцевой модуль включает шприц с подвижным штоком, присоединенным к точному перемещающему механизму, и трехпозиционный клапан, который обеспечивает коммутацию между шприцем, емкостью с реагентом и дозатором (игольчатым или пьезоэлектрическим)».

С невероятной точностью

Теперь перейдем к самой технологии. Но сначала вспомним, что такое олигонуклеотиды. Это небольшие (oligos переводится с греческого как «небольшой», «незначительный») фрагменты ДНК или РНК. Под словом «небольшие» имеются в виду от нескольких единиц до нескольких сотен нуклеотидов (азотистых оснований, тех самых «букв ДНК» A, T, G, C). При этом ДНК обычно двухцепочечная, как ее обычно изображают в виде спирали, или одноцепочечная. РНК преимущественно одноцепочечная. Но когда выполняется химический синтез олигонуклеотидов, это только одноцепочечные последовательности.

«Пришивка одного нуклеотида к растущей цепочке состоит из четырех стадий, — рассказывает Руслан Гадиров. — Вначале мы капаем деблокирующим раствором, который снимает защитные группы с растущих цепочек и делает их восприимчивыми к последующим реагентам. Затем подложка промывается, при этом с нее смываются остатки деблокирующего раствора и те самые защитные группы, которые отсоединились при обработке. Затем раскапывается раствор активатора и амидофосфита — это предшественник наших нуклеотидов (тех самых букв ДНК). Там, куда попала капля с амидофосфитом и активатор, происходит взаимодействие с растущей цепью, и амидофосфит пришивается к группам на поверхности цепи, которые мы деблокировали на первой стадии. При этом у нас все равно остается незначительное количество непрореагировавших групп. Их мы насовсем блокируем с помощью так называемого кэпирующего раствора, чтобы на следующих циклах они не вступали в реакции, поскольку в противном случае они уже дадут укороченный олиг. Это третья стадия, и после нее мы опять промываем подложку».

На четвертой стадии фосфор, содержащийся в присоединенном амидофосфите, переводится из трехвалентного состояния в более устойчивое пятивалентное. И опять подложка промывается, уже от окислителя. Если повторить этот цикл еще раз, но с другим амидофосфитом, то цепь увеличится еще на одну, но уже другую букву. И так, буква за буквой, получается олигонуклеотид.

«Теперь представим, что мы ведем синтез разных последовательностей на разных участках подложки. Зона, в которой происходит синтез, задается только диаметром пятна контакта капли с подложкой — спота. Это порядка 150–180 микрометров. В одни споты капаем одни амидофосфиты, в остальные — другие. Если бы подложка была гладкая (например, стекло), то синтез происходил бы на ее поверхности. Площадь спота можно было бы легко посчитать как πR². Но в случае пористой подложки капиллярные силы затягивают жидкость внутрь пор, которые, как мы уже говорили, представляют собой длинные каналы на всю толщину подложки (порядка 100 микрометров), и синтез происходит по всей поверхности этих каналов. Площадь поверхности гораздо больше, следовательно, и по количеству молекул олигонуклеотидов будет больше. В одном споте будет несколько десятков тысяч таких каналов, в каждом из которых будут расти тысячи одинаковых цепочек. В соседнем споте, куда мы капаем другие реагенты, будут находиться свои каналы, и там растут другие цепочки ДНК. На одной подложке диаметром 20 миллиметров, может располагаться до двух тысяч спотов, в каждом из которых будет синтезироваться своя последовательность».

По словам ученого, важно печатать таким образом, чтобы соседние споты никак не взаимодействовали между собой, то есть чтобы реагенты не смешивались. Для этого между ними должно выдерживаться определенное расстояние. Чтобы в каждом споте количество правильных последовательностей было максимальным, необходимо, чтобы капли с реагентами, дозируемые при помощи пьезодозаторов, на каждом цикле попадали ровно на те участки, где проходит реакция, то есть спот в спот.

«Вроде бы звучит не очень сложно, но, как я уже говорил, диаметр спота составляет 150–180 микрометров (можно варьировать с помощью объема и количества капель), а это чуть больше толщины волоса, которая в среднем составляет 50–80 мкм. И капли должны попадать в такие споты с максимальным перекрытием. Обычно, если мы не используем какие-нибудь хитрые амидофосфиты, а только стандартные, нам нужно, чтобы пять пьезодозаторов (четыре буквы и активатор) были очень точно между собой откалиброваны. При этом если мы хотим высокой скорости печати, то печатающая каретка должна двигаться со скоростью хотя бы 100 миллиметров в секунду, а капли должны вылетать с частотой 100–1000 герц. Погрешность в координатах капли не должна превышать 10 микрометров».

Подложки изготовлены из анодированного оксида алюминия – это нанопористый материал с канальным расположением пор; он имеет большую удельную площадь поверхности, его поры – это непересекающиеся вертикальные сквозные каналы, которые не дают капле растекаться в плоскости подложки, что позволяет обеспечить высокую плотность синтеза

Пресс-служба ТУСУРа

Разница в объемах и скорости

Чтобы понять отличие разработки ученых ТУСУРа от приборов, которые доступны сейчас, расскажем, что представляют собой классические серийно выпускаемые синтезаторы олигонуклеотидов. Это приборы, на которых проводят синтез в колонках либо в планшетах. В качестве твердой фазы выступает стекло с контролируемым размером пор. Принцип такой же, только объемы дозируемых растворов реагентов микролитровые. Там более грубые системы дозирования по сравнению с пьезодозаторами, поэтому невозможно формировать нанолитровые и тем более пиколитровые дозы. На планшетных синтезаторах обычно ведут синтез, когда нужны единицы или десятки разных олигонуклеотидов в нано- или микромолярных количествах.

«В стране у нас такие приборы доступны, более того, они в России производятся, — рассказывает Руслан Гадиров. — Их выпускает новосибирская компания “Биоссет”. Но когда нужна большая библиотека, на 10‒20 тысяч олигов, планшетные синтезаторы с такой задачей уже справляются плохо, на одном приборе за один запуск получается порядка 100 олигов. Можно оценить, сколько потребуется запусков и времени для синтеза 10 тысяч, если один синтез длится примерно сутки».

Впереди — серийное производство

Команде разработчиков геномного принтера еще предстоит большая работа. Необходимо провести множество синтезов, оптимизировать протоколы синтеза, наработать статистику и исправить обнаруженные в ходе экспериментов ошибки.

«Кроме того, на последнем этапе мы разработали проточную ячейку, которую в реальных синтезах протестировать не успели. После этих испытаний один экземпляр прибора, скорее всего, передадим для тестирования нашему научному партнеру ИХБФМ. Мы продолжаем вести совместные исследования по доработке прибора. Шприцевые и пьезоэлектрические дозаторы собственной разработки тоже нужно довести до серийного производства, пока это штучные изделия», — говорит Руслан Гадиров.

По словам ученых, потенциальные заказчики уже есть, причем одни хотели бы приобрести геномный принтер, а кто-то планирует заказывать синтез библиотек олигонуклеотидов. В любом случае необходимо запускать серийное производство. Документация уже разработана. В этом году в планах — сделать еще один экземпляр системы, протестировать его, и, если со стабильностью все окажется в порядке, будет решаться вопрос о запуске в серию.