Новый экспресс-метод обнаружения малых молекул
Первый в мире ультрачувствительный метод, позволяющий быстро находить низкомолекулярные соединения, разработали ученые из Института общей физики им. А. М. Прохорова РАН и Московского физико-технического института. Речь идет об обнаружении следовых количеств токсинов, гормонов, витаминов и биологически активных малых молекул, важных для современной медицинской диагностики, для контроля безопасности пищевых продуктов и многих других целей, сообщает пресс-служба МФТИ. Исследование опубликовано в журнале Analytica Chimica Acta. Работа была поддержана Российским научным фондом.
«Разработанная технология иммуноанализов на основе магнитных нанометок способна не только детектировать малые молекулы, она имеет значительно более широкую область применения, — рассказал “Стимулу” руководитель исследований и заведующий лабораторией ИОФ РАН Петр Никитин. — Например, ранее мы опубликовали результаты в ведущих профильных журналах по высокочувствительной детекции целого ряда других биоактивных веществ и маркеров заболеваний: маркера онкозаболеваний, мультиплексного анализа ботулинических нейротоксинов A, B, и E в пищевых продуктах, маркеров кардиозаболеваний и ряда других агентов. Сейчас мы изучаем, в каком из направлений эта технология может оказаться наиболее востребованной для нашей протяженной страны».
В частности, в силу простоты проведения предлагаемых методов анализа разработка может открыть принципиально новые возможности решения социально значимых задач скрининга онкозаболеваний населения непосредственно в передвижных микроавтобусах, даже в слабооснащенных, а также фельдшерских кабинетах удаленных и малонаселенных регионов.
Разработанный учеными иммунохимический анализ, основанный на магнитных метках, занимает менее получаса, но при этом в сто раз чувствительнее иммуноферментного анализа (ИФА), применяющегося при стандартных лабораторных исследованиях. Эффективность этого подхода была продемонстрирована на примере измерения концентрации в плазме крови человека тироксина — одного из основных гормонов, используемых для мониторинга состояния щитовидной железы. Доступность и простота процедуры разработанной тест-системы позволяют проводить диагностику непосредственно на месте забора биоматериала.
Высокая чувствительность при детекции малых молекул необходима именно потому, что низкомолекулярные вещества зачастую оказывают сильное влияние на организм даже в небольших концентрациях. Сегодня для измерения концентраций таких соединений широко применяется иммуноферментный анализ. Он весьма трудоемкий и может проводиться только квалифицированным персоналом в специально оборудованных лабораториях. Для повышения чувствительности при детекции гормонов щитовидной железы все еще используется радиоиммунный анализ, который основан на применении радиоактивных меток с малым временем полураспада, и поэтому имеет существенные ограничения и потенциально небезопасен. Кроме того, традиционные методы требуют долгой пробоподготовки и наличия специализированного оборудования.
Есть еще и иммунохроматографический анализ (ИХА), используемый, например, в стандартных тестах на беременность. Он менее трудоемок, чем ИФА. Однако такой метод во многих странах одобрен только для получения пороговых результатов и для случаев, не требующих высокой чувствительности анализа. Таким образом, одна из первостепенных задач в области медицинской диагностики — разработка быстрого и простого высокочувствительного метода детекции малых молекул.
Новая аналитическая система, созданная совместно учеными ИОФ РАН и МФТИ, представляет собой модификацию иммунохроматографического анализа с применением магнитных нанометок и бифункциональных лигандов. В качестве модели для изучения ее возможностей было выбрано определение основного гормона щитовидной железы — тироксина, что сообщило работе и клиническую значимость.
Разработанный магнитный иммуноанализ реализован иначе, чем традиционные форматы ИХА. К сыворотке крови пациента, содержащей исследуемый свободный тироксин, добавляются антитела, помеченные магнитными наночастицами, и бифункциональный лиганд тироксина. Бифункциональный лиганд представляет собой молекулу тироксина, ковалентно связанную с биотином с помощью разделяющего их в пространстве «мостика». Антитела на магнитных наночастицах, таким образом, имеют возможность связывать как тироксин из сыворотки крови, так и бифункциональный лиганд. Спустя некоторое время, дав молекулам в растворе возможность связаться друг с другом, его наносят на мембрану. В случае взаимодействия с бифункциональным лигандом частицы задерживаются на тестовой линии из стрептавидина, белка с сильным сродством к биотину. Фактор высокого сродства, а также высокочувствительный подсчет связавшихся с мембраной в результате реакции магнитных нанометок обеспечивают беспрецедентную чувствительность анализа. Достигнутый предел детекции гормона составил 16 фг/мл (или 20 фемтомоль/литр, что соответствует 1 млн молекул в одном миллилитре раствора) в динамическом диапазоне три порядка.
Использованные оригинальные электронные приборы для считывания результатов анализа основаны на сверхчувствительном методе детекции магнитных наночастиц MPQ (англ. — magnetic particle quantification). Он базируется на явлении нелинейного перемагничивания частиц переменным магнитным полем на двух частотах и регистрации индукционного отклика на комбинаторных частотах.
«Разработанные методы измерения концентраций низкомолекулярных веществ используют универсальные иммунохроматографические полоски со стрептавидином на распознающей линии, поэтому их нетрудно тиражировать, — поясняет Петр Никитин. — Многообразие возможных тестов на иные аналиты требует стандартных антител и специальных бифункциональных лигандов, синтез которых для разнообразных малых молекул — весьма непростая задача. К счастью, в нашем арсенале имеются ранее разработанные оригинальные интерферометрические методы и приборы, которые позволяют в режиме реального времени регистрировать динамику молекулярных взаимодействий. С помощью таких приборов были выбраны оптимальные иммунореагенты и бифункциональные лиганды тироксин–биотин, обеспечивающие за счет специальных пространственно разделяющих молекулярных “мостиков” хорошую доступность обеих малых молекул для эффективного взаимодействия с двумя большими молекулами одновременно: с распознающим антителом и со стрептавидином. Это сэкономило много времени при разработке тестов и во многом способствовало успеху в работе».
По словам Петра Никитина, новый метод впоследствии можно будет использовать и на бытовом уровне: «Поскольку во многих случаях количественный и высокочувствительный анализ проводится с помощью сухих реагентов на магнитных тест-полосках, считываемых электронным регистратором, он очень прост в обращении и не требует особой квалификации. Такие анализы потенциально могут проводиться в домашних условиях — на уровне пользователей широко распространенных электрохимических тестов на содержание сахара в крови».