Гиперболоид генного инженера

В конце июля на Международной конференции по СПИДу в Мюнхене были представлены результаты первого испытания генного редактора CRISPR-Cas9 на людях с ВИЧ, проведенного в Университете Вашингтона в Сент-Луисе, и они разочаровали. Только у одного из шести участников эксперимента уровень РНК вируса не восстанавливался после прерывания лечения в течение 16 недель; остальные очень быстро вернулись на исходные позиции прогресса инфекции, как только перестали получать инфузии.

Ранее ученые из нескольких китайских научных и клинических центров в обзоре журнала Frontiers подвели итог многообещающему эксперименту по созданию лекарства против рака легкого (это было первое разрешенное в мире клиническое исследование CRISPR-препарата, анонсированное в Китае еще в 2016 году): «ножницы» для лечения этой конкретной онкопатологии пока не могут быть применены на практике.

Испытания in vivo CRISPR-препарата против острого лимфобластного лейкоза, созданного американской компанией Juno Therapeutics, и вовсе завершились на старте — после смертей двух пациентов от осложнений, вызванных трансплантацией отредактированных клеток.

«Ножницы» для генома

Напомним, CRISPR-Cas9 — это инструмент, созданный на основе системы бактериального иммунитета, он позволяет вырезать «дефектные» участки из ДНК и вставлять в нее новые последовательности, которых изначально там не существовало. Это самая радикальная на сегодня терапия (и хирургия одновременно), нацеленная на изменение базовой «прошивки» пациента — набора его генетической информации.

В теории такие манипуляции на уровне генома дают возможность избавить десятки миллионов людей от мутаций, которые ведут к заболеваниям, связанным с «плохой генетикой», например к сахарному диабету первого типа, сердечно-сосудистым патологиям, некоторым видам рака.

На практике в активе CRISPR-терапии пока только два орфанных препарата (производства американской и американо-швейцарской компаний) — против серповидно-клеточной анемии и бета-талассемии. Они были одобрены в Великобритании и в США в конце прошлого года. По сути, это первые примеры современных возможностей «биохакинга» — впечатляющих, но пока еще не волшебных. Лекарства изготовлены из стволовых клеток самих пациентов, которые собирают, модифицируют и возвращают в виде инфузий в организм, где они прикрепляются к костному мозгу и размножаются, вырабатывая нормальный гемоглобин. Перед введением препаратов пациентам проводят высокодозную химиотерапию, вытравляющую аномальные эритроциты из крови — последствия работы исходного дефектного фрагмента ДНК.

Вероятные побочные эффекты этих лекарств считаются переносимыми (особенно в сравнении с неудобствами, которое доставляет мутантный ген), но в маркировке одного из них значится «черный ящик» — серьезное предупреждение о рисках, так как в ходе экспериментов у двух пациентов возник рак крови.

Тем не менее лекарства работают: в протоколах испытаний говорится, что для отредактированных клеток меньше вероятность образовывать серпы, препятствующие нормальному кровотоку, чего достаточно для лечения заболеваний. Почти никому из участников экспериментов после проведения терапии больше не потребовалось переливания крови. И это действительно революция.

Генный инженер, младший научный сотрудник направления «Генная терапия» университета «Сириус» Андрей Бровин

sirius-ft.ru

Риски технологии

То, что первые успехи CRISPR-редактор показал в гематологии, неудивительно: кровь — самый удобный для научных манипуляций орган человека. С ней можно работать ex vivo: сначала модифицировать в пробирке, а затем повторно вводить в организм.

Но от нобелевского открытия мир ожидает не только точечных прорывов в локальной области. Тем более что в лаборатории ученые уже воспроизводят почти фантастические сюжеты.

«В модификации последнего поколения генный редактор CRISPR-Cas9 способен заменять фрагменты в сто пар оснований, что позволяет одним препаратом полностью устранить причины нескольких синдромов одновременно. Это звучит невероятно, но все же надо признать, что по большей части технология пока остается сырой для внедрения в клинику», — комментирует генный инженер, младший научный сотрудник направления «Генная терапия» университета «Сириус» Андрей Бровин.

Основная причина подвисания CRISPR-терапии на ранних этапах испытаний, о которой говорят и пишут почти все генетики, — офф-таргет — эффект, когда Cas-белок вносит разрыв в ДНК не в том месте, где это запланировано, что может привести к нежелательным последствиям, которые останутся в геноме. Вероятность этих событий, к сожалению, не нулевая (по крайней мере, при нынешнем уровне развития генной инженерии) — все же биологические законы, в соответствии с которыми функционируют живые системы, больше подвержены влиянию случайных событий, чем законы физики и химии.

В исследованиях, проведенных, например, в Институте им. Фрэнсиса Крика в Лондоне, Колумбийском университете в Нью-Йорке и Орегонском медицинском университете в Портленде, было неоднократно показано, что во время восстановления ДНК после вмешательства CRISPR-Cas9 может возникать перетасовка букв генома или даже исчезнуть часть хромосомы.

Вторая проблема — доставка лекарства в клетки. Более ранние версии CRISPR-Cas9 упаковывали в достаточно большие аденовирусы, которые быстро распознавались иммунной системой. В некоторой степени этот вопрос решить удалось: сейчас редакторы уже доставляют в организм с помощью аденоассоциированных вирусов, которые из-за своих малых размеров (всего 20 нм) оказываются практически незаметными для иммунитета. Однако при больших дозах и неоднократном введении иммунная система тоже разоблачает их и начинает выработку нейтрализующих антител.

Третий нюанс выявился в процессе оттачивания «ножниц». Их современные, более филигранные модификации делают с помощью дополнительного фермента — обратной транскриптазы. Такой блок уже не умещается в стандартную ААВ-частицу, поэтому его режут и доставляют по частям, собирая на месте на уровне белковых комплексов. За счет этого транспорт всей системы в клетки организма становится очень сложным технически.

Четвертый минус связан с организацией доклинических испытаний: создавать генно-модифицированных мышей, прививая им, к примеру, человеческие онкогены, оказалось крайне дорого и трудоемко. Китайские ученые даже заявляют о необходимости искать новые подходы к предварительному моделированию заболеваний и их терапии в живом организме.

И наконец, последнее ограничение — по порядку, но не по важности: цена вопроса. Стоимость одной дозы вышедших на рынок CRISPR-препаратов против болезней крови — около 2,2 млн долларов (эта сумма складывается из затратных научных экспериментов с большим количеством расходного материала). Дело даже не в том, что это дорого для медицины: наоборот, такая терапия может заменить годы постоянного приема лекарств, а значит, сэкономить деньги на лечение конкретных заболеваний. Но здесь и сейчас науке в этой области требуются огромные инвестиции, а терпение инвесторов, ожидающих возврата вложений, не безгранично. Так, буквально на днях один их самых крупных стартапов, специализирующихся на технологии CRISPR, — «дочка» Массачусетского технологического института Tome Biosciences, которая ранее привлекла рекордные для этой отрасли 213 млн долларов в рамках двух инвестраундов, — объявила о предстоящем увольнении всех 130 сотрудников. С января Tome безуспешно пыталась найти инвестиции на третий раунд, необходимый для завершения доклинических испытаний уже благополучно опробованного на обезьянах генного лекарства против фенилкетонурии.

Комментируя фиаско американским СМИ, гендиректор компании Рахул Каккар отметил, что «сбор средств в этом проекте стал самой сложной задачей». Настроения инвесторов по отношению к CRISPR-терапии сейчас явно не на подъеме: с начала 2024 года акции шести биотехнологических компаний в этой области рухнули на 25‒65%.

Лауреаты Нобелевской премии по химии 2020 года француженка Эммануэль Шарпантье (справа) и американка Дженнифер Дудна – за разработку методов редактирования генома

nobelprize.com

Что дальше?

Неужели нобелевское открытие Дженнифер Дудны и Эммануэль Шарпантье «закроется» на всех направлениях, кроме гематологии?

Нет, имеются и хорошие сигналы. По всему миру ведутся тысячи экспериментов с редактором CRISPR-Cas9, до начальных стадий клинических испытаний добрались новые кандидаты — китайское лекарство от аутизма, американское — от ангионевротического отека; британское — от семейной гиперхолестеринемии.

В России ученые активно тренируются на культурах клеток. Известно, например, об экспериментах, в которых мишенями являются мутации в генах, ассоциированные с сахарным диабетом (Марийский государственный университет), дистрофии Дюшенна (университет «Сириус»), наследственной глухоты (РНИМУ им. Н. И. Пирогова), нейродегенеративными заболеваниями (Институт цитологии и генетики СО РАН), гемофилией В (МФТИ).

Много надежд при форсировании CRISPR-темы возлагают на искусственный интеллект: с его помощью поиск биомаркеров конкретных заболеваний, а также создание генно-инженерных комплексов для редактирования ДНК могут быть ускорены в сотни и тысячи раз. Однако доклинические и клинические испытания новых систем все равно будут идти по классическим схемам, а это процесс небыстрый.

«Ножницы» должны работать безупречно. Цена их осечки слишком высока — непоправимые изменения в геноме, которые способны причинить большой вред пациенту.

«…Вариации, призванные снизить риск одних заболеваний, часто увеличивают риск возникновения других. Распространенный вариант гена SLC39A8, например, защищает человека от гипертонии и болезни Паркинсона, но увеличивает шанс развития у него болезни Крона и ожирения. Его влияние на многие другие заболевания и взаимодействие с другими генами остается неизвестным… Будет гораздо труднее предсказать последствия совершенно новых генетических конструкций, не говоря уже о том, как будут взаимодействовать многочисленные модификации в будущих поколениях», — говорится в опубликованном в 2019 году в Nature манифесте 18 известных ученых, в числе которых одна из основателей CRISPR-терапии нобелевский лауреат Эммануэль Шарпантье.

Поэтому, пока метод не считается стопроцентно надежным, CRISPR-препараты будут применять лишь при терминальных стадиях серьезных заболеваний, что, собственно, мы и наблюдаем сегодня.

Для почитателей футурологии, которые мечтают о включении в ОМС процедуры редактирования всех нежелательных генетических мутаций, ответственных за предрасположенность к любым человеческим недугам, порокам и слабостям, обнадеживающих новостей пока нет. По словам Андрея Бровина, для получения знания о «наилучшей версии» ДНК для Homo sapiens ученым нужно будет точно связать конкретные полиморфизмы с их влиянием на фенотип, а чтобы получить достоверную информацию по этому вопросу — сделать выборку в несколько миллионов человек каждой из существующих этнических групп, возрастов, вариантов распространенных фенотипов и так далее. Но если представить, что эта фантастическая работа когда-нибудь будет выполнена и полученные данные будут загружены в самую мощную нейросеть — авторы данного эксперимента получат множество уникальных формул для создания разных эликсиров, в их числе может быть и лекарство от всех видов рака, и самый смертельный вирус для уничтожения человечества. Такой вот гиперболоид генного инженера будущего.

Но мы, конечно, рассчитываем на реализацию менее рискованного сценария: разработки и использования CRISPR-препаратов для лечения генетических мутаций, ассоциированных с рядом мучительных и смертельно опасных заболеваний. Даже если за это придется платить миллионы долларов и ждать десятки лет.