Молекулярные ножницы против деменции

Новый вариант CRISPR/Cas ученые упаковали в вирусные частицы, способные доставить его в нервную клетку. Исследование на культуре человеческих нейронов показало, что модифицированный CRISPR/Cas эффективно приостанавливает образование белков, провоцирующих развитие одной из форм приобретенного слабоумия — фронтотемпоральной деменции. Статья об этом статья опубликована в научном журнале Cell.

Технология направленного редактирования геномов CRISPR/Cas9 — одно из самых перспективных направлений в современной генной инженерии. Ученые даже заявили, что с помощью этого метода в будущем можно будет выращивать полноценные органы людей внутри животных .

Технологию CRISPR используют для борьбы с наследственными болезнями. Например, компания CRISPR Therapeutics разрабатывает лекарства для лечения бета-талассемии и серповидно-клеточной анемии .

Применив метод CRISPR/Cas9, американские исследователи удалили вирус ВИЧ первого типа из ДНК трех видов животных, включая мышей с иммунными клетками человека. Ученые из Питтсбургского университета и Медицинской школы имени Льюиса Каца при Темпльском университете впервые доказали, что вирус ВИЧ может быть полностью устранен из инфицированных клеток животных без дальнейшей репликации.

Метод и его история

Что же представляет собой CRISPR/Cas9, или, как его еще называют, «молекулярные ножницы»?

Ёсидзуми Исино, обнаружил первый локус CRISPR у бактерии Escherichia coli в 1987 году

Иллюстрация: http://astrobiology.illinois.edu/

За технологией стоит фундаментальное и очень важное для современной биологии открытие. Оно заключается в том, что огромное число бактерий несет в своем геноме систему адаптивного иммунитета против вирусов. Основа этой системы — особые участки генома: короткие палиндромные кластерные повторы, или CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).

Повторы выступают в роли «полок», между которыми в геноме расположены «досье» на вирусы, с которыми когда-то сталкивались предки той или иной бактерии. «Досье» — это просто короткие фрагменты ДНК, которые совпадают по последовательности с фрагментами генома ДНК вирусов. Если вирус с совпадающей ДНК попадет в бактериальную клетку, он довольно быстро будет распознан специальным ферментом — нуклеазой Cas9. Для поиска вирусной ДНК этот фермент использует синтезированную с CRISPR РНК-копию.

Если какой-либо фрагмент генома вируса точно совпал с тем, что записано в «досье», Cas9 разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате которой вся ДНК уничтожается.

Испанский исследователь Франсиско Мохика начал масштабное изучение CRISPR в 1993 году

Иллюстрация: fleming.pro

Так вот, с помощью этой системы ученые могут, например, отыскивать заданную последовательность ДНК, вносить в нее разрез и заменять одни нуклеотиды на другие. Кроме того, систему можно настроить так, чтобы она не разрезала ДНК, а лишь модифицировала ее работу в данном локусе или, например, просто служила флуоресцентной меткой и указывала на свое местоположение.

Первый локус CRISPR был обнаружен у бактерии Escherichia coli в 1987 году группой японских ученых во главе с Ёсидзуми Исино. Они заметили в геноме этой бактерии повторяющиеся элементы, разделенные неповторяющимися последовательностями (спейсерами). Впрочем, ученые не придали своему наблюдению большого значения.

Масштабное изучение CRISPR начал испанский исследователь Франсиско Мохика, в 1993 году обнаруживший повторяющиеся последовательности, разделенные промежутками, в геноме археи Haloferax mediterranei. Он обратил внимание, что повторы в геномах этой археи и E. coli очень похожи по структуре, однако не имеют ничего общего в последовательностях нуклеотидов. По предположению Мохика, столь похожие по структуре повторы, имеющиеся у систематически весьма далеких групп прокариот, должны выполнять какую-то очень важную функцию. И только в 2005 году ученые поняли, что система CRISPR/Cas связана с адаптивным иммунитетом. А еще через два года было положено начало развитию основанных на CRISPR методов генетической инженерии.

Приложения

Технология «молекулярных ножниц» находит самые неожиданные применения. Так, благодаря CRISPR/Cas9 исследователи Института Броуда и Гарвардского университета разработали «черный ящик» для клеток. Он представляет собой две системы записи событий, которые происходили с ними на протяжении жизни.

Для того чтобы понять, как на самом базовом уровне работают клеточные компоненты, нужно иметь возможность фиксировать клеточные изменения в тот момент, когда они происходят, а также объяснить, что могло их вызвать. Короче говоря, нужен «черный ящик», в котором будут регистрироваться все события, произошедшие с клеткой за время ее жизни.

В прошлом попытки создания такого механизма уже предпринимались, но результаты не были впечатляющими. Сейчас ученые разработали на базе CRISPR аппарат записи множественных событий CAMERA и использовали его для создания двух типов систем, записывающих жизнь клетки.

Первый тип, CAMERA 1, заключается в следующем: в бактериальную клетку вводится пара плазмид, которые слегка отличаются друг от друга. Затем одну из плазмид во время реакции на желаемый стимул разрезают с помощью CRISPR/Cas9, что заставляет клетку создавать еще одну плазмиду, чтобы заменить испорченную. Это создает запись события. Такая технология позволяет накапливать данные о том, как клетки реагируют на стимулы, например на питательные вещества или антибиотики.

Второй тип, CAMERA 2, позволяет использовать базовые методы редактирования букв генетического кода, когда клетка воспринимает желаемые сигналы. С помощью этого аппарата записи специалисты могут фиксировать, как клетка реагирует на вирусы, питательные вещества и антибиотики. Его уже успешно испытали на бактериальных и человеческих клетках.

Появились идеи использовать CRISPR не только для редактирования генома. Новые открытия показывают путь к использованию технологии в качестве диагностического инструмента.

Одну из диагностических систем на основе CRISPR разработали в лаборатории Дженнифер Дудны, одного из пионеров технологии. Ее команда экспериментировала не с привычной структурой CRISPR/Cas9, а с CRISPR/Cas12a, которая при работе дополнительно разрезает находящуюся рядом с ней одноцепочечную ДНК. Эту способность применили для обнаружения двух распространенных типов вируса папилломавирусов человека, ответственных за развитие некоторых видов рака.

Когда CRISPR/Cas12a находила участок вирусной ДНК в инфицированной клетке, она разрезала специальный фрагмент нуклеиновой кислоты с флуоресцентной меткой. В результате сигнал высвобождался, позволяя визуально обнаружить наличие вируса. Система, названная DETECTR, справляется со своей работой примерно за час и стоит меньше доллара. Точность технологии составляет от 92 до 100%.

Фэн Чжан, еще один «ветеран» CRISPR, применил технологию для идентификации вирусов и бактерий, а также для поиска онкогенных мутаций по образцу крови. Система получила имя SHERLOCK. В новом исследовании его команда представила обновленную версию технологии, которая в три раза чувствительнее прежней и способна одновременно идентифицировать вирусы Зика и Денге. Система использует несколько версий CRISPR, в том числе Cas13 и Csm6.

Список болезней, которые можно победить с помощью CRISPR, постоянно пополняется. Недавно к нему добавился синдром Мартина—Белл, основная причина слабоумия у мужчин. Ученые получили прямые доказательства того, что удаление определенной мутации может вылечить поврежденные болезнью нейроны.

Недавно удалось придумать метод, позволяющий применять технологию CRISPR без разрезания ДНК, это позволит уменьшить риск нежелательных генетических мутаций .

Сейчас развитие методики во многом сдерживают этические ограничения. Чтобы проводить генетические исследования на человеке, ученым необходимо соблюдать множество правил. Благодаря отказу от этих правил в лидеры CRISPR-технологий сейчас стремительно выходит Китай .

В России

В короткие сроки разработать программу масштабных геномных исследований в нашей стране поручил Владимир Путин. Президент сделал это заявление в начале февраля на заседании Совета по науке и образованию, посвященного вопросам глобальной конкурентоспособности российской науки. А меньше чем через месяц был опубликован план развития биотехнологий и генной инженерии на ближайшие два года. В России планируется создать центры компетенций в области генетического редактирования. Свои предложения уже готовят эксперты, правительство рассмотрит их в июне.
Главное сейчас — «транслировать» накопленные знания в клинические эксперименты, а впоследствии — в терапию.

«Очень важно, чтобы Российская Федерация достаточно оперативно отреагировала на этот глобальный вызов, — заявил руководитель лаборатории геномной инженерии МФТИ Павел Волчков. — Если мы правильно построим свою политику, сфокусируемся на определенных объектах и темах, не будем размывать финансирование, то, может быть, мы действительно сможем создать что-то передовое, не то что не отстать, а даже обогнать».

Купировать риски

Долгосрочные последствия процедуры редактирования генома сейчас предсказать трудно. Эффективность редактирования с помощью CRISPR/Cas9 пока недостаточна для того, чтобы говорить о «точном как скальпель» исправлении генома. Одновременно с нужным разрывом в геном часто вносятся и лишние, а это, как уже отмечалось, провоцирует мутации. Даже если разрыв внесен правильно, эффективность гомологичной рекомбинации, за счет которой происходит замена исходной последовательности на нужную, очень далека от 100 процентов.

Какова реальная эффективность — вопрос более сложный, чем кажется, ведь она сильно зависит от типа и природы клеток, в которых проводится редактирование. То, что хорошо работает на мышах, может плохо работать на людях. И пока не появится возможность экспериментировать с реальными человеческими клетками, об эффективности процедуры и уровне случайных разрывов можно будет только гадать, говорят исследователи.

Между тем на смену ставшей уже классической технологии приходят новые. CRISPR стала началом революции, но сама по себе уже устарела, будучи немного неуклюжей, ненадежной и небезопасной. К примеру, одним из недостатков является то, что у нее нет тормоза, ведь это оружие, призванное уничтожать вирусную ДНК. Чтобы снизить риски, исследователи разрабатывают инструменты для контроля над работой комплекса .